PCR - Info

Die Polymerase-Kettenreaktion

Überblick

Definition

PCR ist eine Abkürzung für Polymerase Chain Reaction (engl.), einem Verfahren welches im deutschsprachigen Raum als Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet wird.

Ziel einer solchen Polymerase-Kettenreaktion ist es die DNA, also Erbsubstanz, zu vervielfältigen. Zum Beispiel ist dies notwendig, wenn von dieser DNA keine ausreichende Menge zur Verfügung steht.

PCR einfach erklärt

Bricht man den Namen in seine Bestandteile auf, erklärt sich das zugrundeliegende Prinzip dieses Verfahrens:

Ein Enzym namens „DNA-Polymerase“ wird innerhalb einer biochemischen Reaktion benutzt. Zusätzlich handelt es sich um eine Kettenreaktion: das Endprodukt der Reaktion dient gleichermaßen als Ausgangspunkt für eine weiter, gleichartige Reaktion.

PCR Test einfach erklärt

Ein PCR Test ist eine Methode mit der man das Vorhandensein von einem bestimmten Ausgangsmaterial überpüfen kann.

Indem man das Ausgangsmaterial mithilfe einer PCR vervielfältigt kann man diese im Anschluss nachweisen.

Ein COVID-19 PCR Test vervielfältigt zum Beispiel das virale Erbmaterial. Selbst wenn dieses nur in kleinen Mengen in der Probe aus Schleimhäuten der Atemwege zu finden ist, wird es mit der PCR so stark vermehrt, dass man es detektieren kann.

Auch ein Haar, wie man es oft in Krimi-Filmen sehen kann, reicht aus um das darin enthaltene Erbmaterial so zu vermehren, dass ein genetischer Profil des Täters erstellt werden kann.

Der Ablauf einer PCR

Wie funktioniert eine PCR?

Die PCR kann in drei Abschnitte unterteilt werden: Denaturierung, Primerhybridisierung und Elongation.

Abb.1.: Eine Polymerase-Kettenreaktion wird in drei charakteristische Schritte eingeteilt. Während der Denaturierung erfolgt eine Trennung der beiden DNA-stränge. Darauf folgt die Primerhybridisierung bei der die Primer an ihre jeweiligen Ausgangsmatrizen binden. Zum Schluss erfolgt die Synthese des "neuen Materials" während der Elongation .

Denaturieung

Bei der Denaturierung, werden die beiden Einzelstränge der doppelsträngigen DNA mithilfe von Hitze voneinander getrennt. Dabei brechen die Wasserstoffbrückenbindungen, die zuvor beide Stränge zusammen gehalten haben.

Primerhybridisierung

Primerhybridisierung nennt man das binden der Primer a die Einzelstränge. Hierfür sind Primer notwendig. Primer sind Oligonukleotide. Diese wurden so ausgewählt, dass sie an einen bestimmten Abschnitt innerhalb des zu vervielfältigen Strangs binden (hybridisieren).

Das PCR Primer Design spielt eine besondere Rolle im Verlauf einer PCR. Hierbei ist auf verschieden Kriterien zu achten, damit eine fehlerlose Bindung an die Ausgangs-DNA möglich ist. Nicht selten werden daher mehrere Variante erstellt und in der Praxis getestet.

Die Polymerase kann im nächsten Schritt dann an diese Primer binden und damit beginnen die DNA zu replizieren.

Verlängerung, Elongation oder Amplifikation

Als Verlängerung, Elongation oder Amplifikation bezeichnet man den Prozess der eigentlichen Vervielfältigung. Hierbei wandert DNA-Polymerase Stück für Stück die Nukleotide des DNA-Einzelstranges ab. Währenddessen erstellt Sie mithilfe von freien Nukleotiden (Desoxy-Nukleotiden = dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ein komplementäres Gegenstück zum Ausgangsstrang. Dieser stellt somit eine identische Kopie des anderen Einzelstranges dar.

Jeder dieser Prozesse weist eine besondere Temperatur auf. Dies ist daher auch der Grund das eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird wie zum Beispiel die Pfu- oder die Tag-Polymerase. Außerdem ist ein ständiger Wechsel je nach Reaktionsschritt und Zyklus nicht manuell möglich, daher wird eine PCR in einem sogenannten Thermocycler durchgeführt. Wie der Name schon beschreibt, handelt es sich hierbei um eine PCR Maschine, die unterschiedliche Temperaturen in definierten Zyklen durchläuft.

Eine Auswahl unserer DNA-Polymerasen

PCR Mastermix Bestandteile

Um den Ablauf einer PCR so einfach wie möglich zu gestalten wird oft ein PCR Mastermix verwendet. Bestandteile eines PCR Mastermix sind die Polymerase, ein passender Reaktionspuffer, MgCl2 sowie Nukleotide (dNTPs), die als Bausteine für die neuen „Kopien“ dienen.

Eine Auswahl unserer PCR-Mastermixe

Einsatz eines PCR Tests zur Erkennung von Krankheiten

Nicht nur für die Vervielfältigung von DNA für ein anstehendes Experiment kann die PCR Methode von Vorteil sein.

Erbkrankheiten sind bedingt durch Veränderung im Genom. Mithilfe einer PCR kann das spezifische Gen vervielfältigt werden. Im Anschluss folgt dann eine Sequenzierung des Materials wodurch eine mögliche Mutation detektiert werden kann.

Auch bei der Diagnose viraler Erkrankungen wie einer Infektion mit dem HI-Virus kann ein PCR Test helfen. Hierbei wird die Virus-DNA vervielfältigt und kann danach untersucht werden. Handelt es sich um RNA-Viren wird die RNA durch eine Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. So ist eine Amplifikation mittels PCR wie zuvor beschrieben möglich (RT-PCR).

HIV-PCR Test

Auch für den Nachweis von HIV kann ein PCR Test eingesetzt werden. Dabei bietet er einen zentralen Unterschied zu anderen Tests an: Während andere Test den Nachweis von Antikörpern durchführen, wird bei einem HIV-PCR Test der HI-Virus detektiert.

Herauszustellen ist hierbei jedoch, dass dieser HIV-PCR Test eher im Kontext einer Therapie, oder im Zusammenhang mit einem Antikörper-Suchtest als Kontroll-Test genutzt wird. Hierbei soll das zuvor erlangte Ergebnis lediglich erneut bestätigt werden.

Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

Ähnlich wie die PCR wird auch die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in drei Schritte unterteilt: Aufreinigung der RNA, reverse Transkription der RNA in DNA und Amplifikation der so generierter cDNA.

Während wir zuvor die Polymerase kennen gelernt haben, folgt in dieser Variante der PCR die Einführung eines weiteren Enzyms: die Reverse Transkriptase. Diese stammt ursprünglich aus Retroviren. Für die industrielle Nutzung wird dieses allerdings Enzym weiter verändert. So wurde zum Beispiel meist dessen RNase H-Aktivität entfernt.

Bei der Reversen Transkriptase handelt sich auch um eine DNA-Polymerase. Der Unterschied zur „normalen“ Polymerase besteht allerdings darin, dass die Reverse Transkriptase RNA als Ausgangsmaterial benötigt. Sie wird daher auch als RNA-abhängige DNA-Polymerase bezeichnet. Mithilfe eines DNA-Primers kann diese dann die sogenannte Komplementär-DNA (cDNA) erstellen.

Der Unterschied zwischen DNA und cDNA besteht darin, das letztere keine Introns aufweist. Dies ist durch die Tatsache begründet, dass cDNA mittels eines RNA-Strangs erzeugt wird, welcher bereits den Splicing-Prozess durchlaufen hat.

Eine Auswahl unserer Produkte für die RT-PCR

Real Time Quantitative PCR

Bei der Real Time Quantitative PCR (kurz qPCR) handelt es sich um eine übliche PCR, bei der zusätzlich die synthetisierte DNA quantifiziert wird. Der Begriff „Real Time“ bezieht sich dabei auf den Quantifizierungs-Prozess: Mittels Fluoreszenz wird die Zunahme des Materials in Echtzeit gemessen.

Eine Möglichkeit besteht dabei zum Beispiel in der Verwendung von DNA-Farbstoffen. Gebräuchlich sind unter anderem Ethidiumbromid oder SYBR Green I. Nach erfolgreicher Synthese des komplementären Strangs steht das Ausgangsmaterial wieder als Doppelhelix-Strang zur Verfügung. Die entsprechenden Farbstoffe können dann in die DNA interkalieren und färben diese somit an. Die Zunahme an synthetisierten Material ist dabei proportional zur Fluoreszenz-Intensität des Reaktionsansatzes.

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Real Time Quantitative PCR für den Nachweis von SARS-CoV-2

Angesichts der schnellen Ausbreitug von SARS-CoV-2 ist die Nachfrage nach direkten und indirekten Nachweismethoden für COVID-19 weltweit rasant angestiegen. Zu den indirekten Nachweismethoden zählen serologische Test, die entweder auf einem SARS-CoV-2-Antikörpernachweis oder einem SARS-CoV-2-Antigennachweis basieren. Meist müssen solche Test allerdings mit einem direkten Virusnachweis kombiniert werden. Die RT-qPCR ist hierbei der am weitesten verbreitete Test.

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Mögliche PCR Fehlerquellen

Es gibt Zahlreiche Dinge, die bei einer PCR schief laufen können (aber nicht müssen).

So spielt meiste die richtige Konzentration der einzelnen Reagenzien eine wichtige Rolle. Besonders sollte hier auf die dNTPS, die MgCl-Lösung, die Polymerase und das Template geachtet werden.

TIPP: Vor allem als Laborneuling hilft es sich mit den Kolleginnen und Kollegen auszutauschen und nach deren Standard PCR-Protokoll zu fragen. Diese sind meist schon lange etabliert. Bei der Gelegenheit darf man eventuell sogar deren entsprechend voreingestelltes Thermocycler Programm mitbenutzen.

Denn auch ein falsches Thermocycler-Programm kann eine mögliche PCR Fehlerquelle sein.

Wenn die DNA-Polymerase allerdings gar nicht mit der Arbeit beginnen kann bei einer PCR auch kein Material vervielfältigt werden. Dies kann zum Beispiel an einem fehlerhaften Primer-Design liegen.

TIPP: Es ist empfehlenswert zu Beginn des Experiments mehrere Primer-Pärchen synthetiseren zu lassen. So hat man immer ein Back-Up falls ein Paar nicht funktioniert und falls doch alle binden hat man eine zusätzliche Kontrolle eingebaut.

Weitere Überlegungen

Maximale Länge einer Ziel-DNA, die durch PCR amplifiziert werden kann

Die Länge der Ziel-DNA, die durch PCR vervielfältigt werden kann, wird durch Faktoren wie die Spezifität der Primer und die Effizienz der Taq-Polymerase begrenzt, so dass es wichtig ist, diese Einschränkungen zu verstehen, um die geeignete Technik für ihre Experimente zu wählen.

Optimale Annealing-Temperatur für die PCR-Amplifikation eines bestimmten Zielgens

Die Entscheidung für eine bestimmte Annealing-Temperatur trägt dazu bei, die Effizienz der Primerbindung an die Ziel-DNA zu bestimmen.

Somit beeinflusst sie die Spezifität und Ausbeute der PCR-Reaktion.

Häufig gestellte Fragen:

Was ist ein PCR Test?

Ein PCR Test ist ein Nachweis-Test bei dem die Anwesenheit von einer spezifischen DNA (oder RNA) mittels dessen Amplifikation gezeigt wird.

Was ist PCR Diagnostik?

In der Diagnostik kann mittels eines PCR Test z.B. ein zugrunde liegender Gendefekt nachgewiesen werden.

Wie lange dauert ein PCR Test?

Die Dauer eines PCRT Test hängt von der Anzahl der verwendeten Zyklen ab.

Wer hat die PCR erfunden?

Kary Mullis ist der Erfinder der PCR.

Was ist ein Primer in der Biologie?

Ein Primer ist ein Oligonukleotid. Dieses einzelsträngige DNA Fragment dient als Startpunkt für die DNA-Polymerase und wird gezielt innerhalb einer PCR eingesetzt.

Welches Enzym entfernt die Primer?

Die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Polymerase I oder die RNase H entfernt Primer bei Prokaryoten.

Warum gibt es Okazaki Fragmente?

Bedingt durch die 5‘-->3‘ Syntheseaktivität der DNA-Polymerase werden am Folgestrang (komplementär zum Leitstrang) diskontinuierliche, kleine DNA Fragmente generiert. Diese Abschnitte werden als Okazaki Fragmente bezeichnet.

Was ist die am häufigsten verwendete Taq-Polymerase in der PCR?

Die Taq-Polymerase ist die in der PCR am häufigsten verwendete DNA-Polymerase.

Welchen Einfluss hat die Mg2+-Konzentration auf die PCR-Amplifikationseffizienz?

Mg2+-Ionen sind wichtige Cofaktoren für die Taq-Polymerase, und die Variation ihrer Konzentration kann die Ausbeute und Spezifität der PCR-Reaktion beeinflussen.

Was ist der Unterschied zwischen Hot-Start und normaler PCR?

Die Hot-Start-PCR ist eine Modifikation der normalen PCR, die darauf abzielt, die unspezifische Amplifikation zu reduzieren, indem verhindert wird, dass die Taq-Polymerase zu Beginn der Reaktion aktiv ist.