IHC - Info

Immunohistochemie (IHC)

Einleitung

Die Immunhistochemie ist eine Labortechnik, bei der das Vorhandensein und die Lokalisierung von Zellbestandteilen mit Hilfe von konjugierten Antikörpern sichtbar gemacht wird. Nach ihrer Visualisierung können diese Zielantigene unter dem Mikroskop analysiert werden. Diese Technik hilft insbesondere bei der Analyse des visualisierten Proteins im zellulären und subzellulären Kontext.

Geschichte

Ausgehend von der Entdeckung der Antikörper und ihrer Fähigkeit, spezifische Antigene zu binden, führte die Konjugation von Farbstoffen mit einem Antikörper zur Erfindung der Immunhistochemie im Jahr 1941 (Coons, Creech, & Jones, 1941).

Anwendungen

Die Methode zum Nachweis eines Antigens mittels Immunhistochemie wird manchmal auch als immunhistochemischer Test bezeichnet. Die Anwendung selbst basiert auf dünnen Gewebeschnitten auf einem Glasträger, die mit Antikörpern angefärbt werden.

Später wurde die Anwendung weiterentwickelt, und es wurden Gewebe-Mikroarrays entwickelt, bei denen sogar mehrere dieser dünnen Gewebeschnitte auf einem einzigen Objektträger verwendet wurden.

Die Immunhistochemie wird in der Diagnostik, der Forschung und der Arzneimittelentwicklung eingesetzt.

Diagnostik von Krankheiten

Eine spezifische Anwendung der Immunhistochemie ist die Diagnose von Krankheiten durch den Nachweis spezifischer Tumormarker. Der Arzt kann dadurch z. B. zwischen gutartigen und bösartigen Tumoren unterscheiden. Zu den weiteren diagnostischen Beobachtungen gehören der Schweregrad des Tumors sowie seine zelluläre Herkunft im Falle einer Metastasierung, die zur Lokalisierung des Primärtumors führt.

Tabelle von diagnostischen IHC Markern:

Biologische Forschung

Die Immunhistochemie wird häufig als eigenständige Technik eingesetzt, kann aber auch mit anderen Techniken kombiniert werden.

Zu den weit verbreiteten Anwendungen gehören Studien über:

Entwicklung von Medikamenten

Eine Möglichkeit, die Immunhistochemie für die Entwicklung von Arzneimitteln zu nutzen, besteht darin, Krankheitsmarker zu färben und zu analysieren, ob sie hoch- oder herunterreguliert werden.

Proben Vorbereitung

Gewebeentnahme und Perfusion

Während die Visualisierung des Vorhandenseins und der Lokalisierung zellulärer Komponenten eine wichtige Säule für viele Forschungsbereiche darstellt, muss das entnommene Gewebe zunächst konserviert werden, um zu verhindern, dass die zellulären Proteine zerfallen und sich abbauen.

Vor der Fixierung oder Konservierung wird das Gewebe häufig in vivo oder in vitro perfundiert oder einfach gewaschen, um jegliches Blut zu entfernen..

Dieser Schritt dient dazu, Antigene aus dem Blut zu entfernen, die den Nachweis des Zielantigens behindern können.

Bei betäubten Tieren wird das Tier mit einer Peristaltikpumpe ausgeblutet, um das Gewebe zu durchbluten. Dann werden alle Blutbestandteile aus dem gesamten Tier oder sogar aus dem (den) Zielorgan(en) entfernt, indem das Gefäßsystem mit steriler Kochsalzlösung gespült wird. Als letzter Schritt erfolgt die Entnahme und Fixierung des Gewebes.

Gewebe Fixierung

Der zugrunde liegende Mechanismus der Gewebefixierung ist die Vernetzung von Proteinen und die Verringerung ihrer Löslichkeit. Wird dieser Schritt nicht sorgfältig durchgeführt, besteht eines der häufigsten Probleme darin, dass die Zielantigene für den Nachweisantikörper nicht zugänglich sind.

Formaldehyd (Formalin) hat sich als das Fixiermittel schlechthin etabliert. Es vernetzt Proteine im Gewebe kovalent, ist halbreversibel und kann für die Fixierung durch Eintauchen oder Perfusion verwendet werden.

Anschließend wird das formaldehydfixierte Gewebe in Paraffin eingebettet, damit es mit einem Mikrotom geschnitten werden kann. Die abgeschnittenen Scheiben werden als formalinfixierte und in Paraffin eingebettete oder FFPE-Gewebeschnitte bezeichnet.

Gewebeeinbettung

Formalin-fixierte Gewebeproben

Paraffin wird routinemäßig zur Einbettung formalinfixierter Gewebeproben verwendet, nicht nur, um eine unveränderte Gewebestruktur während einer Langzeitlagerung zu gewährleisten, sondern auch, um eine einfache Gewebeschneidung zu ermöglichen.

Gefrorene oder Kryoschnitte

Das Einbetten des Gewebes in kryogenes Material und das Einfrieren in flüssigem Stickstoff ist eine Alternative für Gewebeproben, die für eine chemische Fixierung oder die Beseitigung des Paraffins anfällig sind.

Analog zu Paraffin müssen gefrorene Gewebeproben mit einem Kryostat in dünne Scheiben geschnitten werden. Nach dem Schneiden werden die Schnitte auf Objektträger gelegt und schließlich getrocknet.

Die Methode des Gefrierschnitts bringt jedoch Nachteile mit sich, die berücksichtigt werden müssen, wie z. B:

Schneiden und Mounting

Schneiden und Einbetten von FFPE-Gewebe

Mit einem Mikrotom werden FFPE-Gewebeproben in dünne Schnitte von 4 bis 5 μm geschnitten. Anschließend werden die Glasschlitten mit 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS) oder Poly-L-Lysin behandelt. Dies führt zur Bildung von Aminogruppen auf der Glasoberfläche. Dadurch haftet das Gewebe, das auf die Objektträger gelegt wird, an diesem Gewebekleber.

Nach dem Einbetten müssen die Schnitte schließlich durch Erhitzen in der Mikrowelle oder im Ofen dehydriert werden.

Schneiden und Einbettung von Gefrierschnitten

Ähnlich wie bei FFPE-Gewebeproben werden Gefrierschnitte mit einem Kryostat geschnitten und anschließend auf einen Glasträger mit Klebefläche gelegt. Das Trocknen der Schnitte erfolgt bei Raumtemperatur in der Regel über Nacht.

Die anschließende Fixierung erfolgt mit Aceton, das auf -20 °C abgekühlt wurde, oder mit Paraformaldehyd oder Formaldehyd/Formalin bei Raumtemperatur.

Entparaffinierung

Um zu verhindern, dass die spezifischen Antigene, die durch die IHC-Färbung nachgewiesen werden sollen, verborgen werden, muss das Paraffin in den FFPE-Schnitten vollständig entfernt werden.Xylol, ein brennbares, giftiges und flüchtiges organisches Lösungsmittel, hat sich als Standardreagenz für die Entparaffinierung von FFPE-Objektträgern etabliert.

Epitop-(Antigen)-Rückgewinnung

Wie bereits erwähnt, kann der Prozess der Vernetzung von Proteinen (Methylenbrücken, die durch Formaldehyd-Fixierung entstehen) die Antigene verdecken, die nachgewiesen werden sollten. Beim Epitop-Retrieval werden die Epitope wieder verfügbar und zugänglich gemacht. Während die Entparaffinierung unbedingt erforderlich ist, wird der Schritt der Epitop-Retrievalisierung nur gelegentlich notwendig und sollte zu Beginn der Experimente festgelegt werden.

Hitze-induzierter Epitopgewinnung (HIER)

Die Demaskierung der Zielantigene kann durch Hitzeeinwirkung erfolgen, während die Probe in verschiedene Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten getaucht wird.

Traditionell werden die Gewebeschnitte 15-20 Minuten lang in einem sauren Citratpuffer druckgekocht.

Proteolytische Epitopgewinnung

Alternativ dazu können Epitope auch durch proteolytischen Verdau der Gewebeschnitte demaskiert werden. Üblicherweise werden Pepsin, Trypsin oder Proteinase K als Enzyme für diesen Prozess verwendet.

Quenching/Blockierung der endogenen Zielaktivität

Biotin und seine Bindungsproteine wie Strept(Avidin) (SA), NeutrAvidin (NA) und Avidin (AV) haben sich als die gängigste Methode zur Verstärkung des Signals durch Erhöhung der Menge der an das Gewebe gebundenen Enzymmoleküle etabliert.

Darüber hinaus wird der enzymvermittelte Nachweis von Zielantigenen durch die Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase (AP) üblicherweise für den Zielnachweis durchgeführt.

Ein Hindernis für beide Prinzipien sind endogene Formen dieser Proteine, die ihre Bindungspartner binden, stören oder sogar maskieren können, was zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Die Maskierung dieser Proteine, um diese unerwünschten Nebeneffekte zu beseitigen, wird als Inaktivierung oder Quenching bezeichnet.

Blockierung unspezifischer Stellen

Trotz der Tatsache, dass Antikörper eine Vorliebe für bestimmte Epitope haben, können sie schwach oder teilweise an Nicht-Antigen-Proteine binden, die die eigentlichen Bindungsstellen des Zielantigens imitieren.

Diese unspezifische Bindung verursacht eine starke Hintergrundfärbung, da sie den Nachweis des Zielantigens verhindern kann.

Aus diesem Grund werden Puffer verwendet, die verhindern, dass primäre oder sekundäre Antikörper an unspezifische Stellen binden. Sie bestehen aus einem Standard-Blocking-Puffer, der mit normalem Serum, fettfreier Trockenmilch, BSA (Rinderserumalbumin), Gelatine und einem oder mehreren sanften Tensiden zur besseren Benetzung gemischt wird.

Probenfärbung

Immunodetektion - Immunhistochemische Färbung

Primäre und sekundäre Antikörper werden in einem Puffer verdünnt, der die Stabilisierung der Antikörper unterstützt, eine gleichmäßige und gründliche Diffusion der Antikörper in die Probe fördert und unspezifische Bindungen verhindert.

Es ist wichtig, die Probe zwischen den Antikörperanwendungen zu spülen, um ungebundene Antikörper und Antikörper, die nur lose an unspezifische Stellen gebunden sind, zu entfernen.

Für den Antikörper-vermittelten Antigennachweis werden direkte und indirekte Methoden verwendet.

Indirekter Antigennachweis

Die meisten indirekten Methoden nutzen die natürliche Affinität von Strept(avidin) und verwandten Proteinen für Biotin, um einen Antikörper nachzuweisen, der biotinyliert und an das Zielantigen gebunden wurde.

Die Zugabe eines enzymkonjugierten Strept(Avidin)-Konjugats hilft beim Nachweis des antigengebundenen Antikörpers und führt darüber hinaus zu einer Signalverstärkung.

Direkter Antigennachweis

Der direkte antikörpervermittelte Antigennachweis wird in den chromogenen und den fluoreszierenden Nachweis unterteilt.

Beim chromogenen Antigennachweis werden primäre oder sekundäre Antikörper verwendet, die mit Enzymen wie Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert sind (Chromogene Immunhistochemie = CIH).

Diese Enzyme bilden nach Inkubation mit ihren spezifischen Substraten unlösliche, gefärbte Präzipitate, die es ermöglichen, den Bereich ihrer Aktivität sichtbar zu machen. Übliche Substrate sind DAB und AEC für HRP sowie Fast Red und NBT/BCIP.

Primäre oder sekundäre Antikörper, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, werden für den fluoreszenzvermittelten Antigennachweis mittels Fluoreszenzmikroskopie (Immunfluoreszenz = IF) verwendet.

Gegenfärbung

Die zusätzliche Anfärbung zellstrukturspezifischer Komponenten ist ein wertvolles Element der visuellen Differenzierung und Orientierung. Sie wird im Anschluss an die Primärfärbung hinzugefügt.

Im Laufe der Jahre haben sichHämatoxylin,Eosin, Nuclear Fast Red, Methylgrün, DAPI und die Fluoreszenzfärbung Hoechst als bevorzugte Gegenfärbungen etabliert.

Außerdem sollten geeignete Kontrollen in das Färbeset aufgenommen werden. Dazu gehören gewebespezifische Antigene (Positiv- und Negativkontrolle) und Reagenzienkontrollen (Puffer-/Antikörperverdünnungskontrolle und Isotypkontrolle).

In der Immunohistochemie ist eine Negativkontrolle ein Gewebeschnitt, bei dem sicher ist, dass dieser das Zielantigen nicht aufweist. Dies erlaubt unspezifische Signale und falsch positive Ergebnisse auszuschließen.

Versiegeln der gefärbten Probe

Nach Beendigung der Färbung sollte die Probe konserviert werden, um sie für eine spätere Verwendung zu erhalten und eine enzymatische Produktauflösung oder ein Ausbleichen der Fluorophore zu vermeiden.

Das Gewebesegment und die Färbung werden durch Einbetten der Probe auf einem Deckglas mit dem geeigneten Einbettungsmittel gesichert.

Die Verlängerung der Fluoreszenzanregung der Fluorophore wird durch Zugabe eines Antifade-Reagens erreicht. Schließlich kann das Deckglas mit Nagellack oder einem handelsüblichen Versiegelungsmittel versiegelt werden.

Probenvisualisierung

Die Schnitte sind nun bereit für die Analyse und den Vergleich mit anderen Schnitten durch Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie.

Immunohistochemie und SARS-CoV-2

Häufige experimentelle Probleme

Neben unspezifischer Färbung oder Gewebeschäden sind das Fehlen von Färbungen und ein hoher Hintergrund die häufigsten Probleme.

Keine Färbung

Bleibt die Färbung aus, so ist dies in der Regel auf ein Problem bei der Antikörper-Antigen-Bindung zurückzuführen. Möglicherweise sind sie nicht kompatibel, ihre Konzentration ist nicht hoch genug oder der Antikörper wurde nicht richtig gelagert.

Starkes Hintergrundsignal

Wenn Sie einen sehr hohen Hintergrund sehen, könnte die Ursache eine unzureichende Blockierung, eine unspezifische Antikörperbindung oder eine zu hohe Antikörperkonzentration sein.

Immunohistochemie Protokol - Auf einen Blick

1. Gewebevorbereitung/fixierung

2.Antigenrückgewinnung

3. Blockierung von endogenen Enzymen

4. Blockierung unspezifischer Bindungsstellen

5. Primäre vs. sekundäre Antikörperverwendung

6.Wahl des Chromogens oder Fluorochroms

7. Gegenfärbung und Montage

8.IHC-Kontrolle

Zellstrukturen und ihre IHC-Marker

Häufig gestellte Fragen

Was ist der Unterschied zwischen Immunhistochemie und Immunfluoreszenz?

Die Immunhistochemie beschreibt die immunologische Färbung von Gewebe, während die Immunfluoreszenz die Verwendung von fluormarkierten Antikörpern beschreibt, um Zielantigene durch Fluoreszenz sichtbar zu machen.