HPLC-MS – Info

Ultrahochleistungsflüssigkeits-chromatographie mit gekoppelter (Tandem-)Massenspektrometrie (kurz: HPLC-MS(/MS)

Der große Vorteil einer HPLC-MS(/MS) Analyse ist die Möglichkeit mehrere Analyten parallel aus einer Probe und über einen großen Konzentrationsbereich hinweg nachzuweisen (Köhrle und Richards 2020).

Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC)

Bei der HPLC handelt es sich um eine instrumentell-analytische Trennmethode, bei der die Analyten unterschiedlich stark mit einer stationären Phase (analytische Säule) wechselwirken, während sie von einer mobilen Phase transportiert werden.

Bei den wichtigsten Trennmechanismen handelt es sich um Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch und Molekülausschluss bzw. Größenausschluss (Schwedt 2008). Unterschieden wird zwischen Normalphasen-Chromatographie (Normal Phase Chromatography, NPC) und Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed Phase Chromatography, RPC) unterschieden. Grundsätzlich besteht ein solches Gerät aus vier Hauptbestandteilen: Pumpe, Einspritzsystem, Trennsäule und Detektor mit Auswertesystem.

Die Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatografie (UHPLC)

Die Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatografie (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) stellt eine Weiterentwicklung der „klassischen“ HPLC dar und ist leistungsstärker (dank höherer Drücke), effizienter und wirtschaftlicher (Gey 2015). In der UHPLC werden Säulen mit Partikelgrößen ca. 2 μm eingesetzt, wodurch ein Säulenvordruck von mehreren Hundert bar nötig wird. Die Säulenlängen liegen im cm-Bereich und die Analysenzeiten können sogar nur Sekunden betragen; meist sind es nur wenige Minuten (Gey 2015). Generell ist die Trennleistung von vielen, sich gegenseitig beeinflussenden Faktoren abhängig.

Die Säulenlänge erhöht die Anzahl an theoretischen Böden und beeinflusst damit indirekt wie lange die Substanz mit der stationären Phase wechselwirken kann, der Säuleninnendurchmesser beeinflusst u.a. den Druck mit dem die HPLC betrieben wird. Je kleiner die Partikelgröße der stationären Phase ist, desto größer ist die Oberfläche, an der die Wechselwirkungen stattfinden und desto größer der Rückdruck. Auch die Fließgeschwindigkeit beeinflusst wie lange die hydrophobe Bindung zur stationären Phase ist. Ist die Fließgeschwindigkeit hoch, ist die Wechselwirkung weniger stark/intensiv und die Auftrennung gegebenenfalls schlechter.

Normalphasen-Chromatographie und Umkehrphasen-Chromatographie

Bei der NPC werden polare stationäre Phasen verwendet, welche Aluminium-und Sauerstoffmoleküle an ihrer Oberfläche haben. Diese weisen absorptive Eigenschaften auf, weshalb polare Analyten stärker mit ihnen wechselwirken und somit später eluieren. Sie bilden Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und induzierte Dipole sowie π-Komplexbindungen aus. Die mobile Phase ist klassischerweise ein relativ unpolares Lösungsmittel. Die RPC verhält sich umgekehrt. Bei der RPC werden hydrophobe stationäre Phasen eingesetzt, welche durch Modifizierung der Silanolgruppen (Si-OH) langkettige Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise C8-, oder C18 Ketten, tragen. Aus sterischen Gründen kann nur etwa die Hälfte der Moleküle modifiziert werden, die restlichen freien Silanolgruppen auf Oberfläche können ggf. mit Hilfe von kleineren unpolaren Molekülen gesättigt werden (engl. endcapping). RP-Materialien binden bevorzugt unpolare Substanzen durch hydrophobe Wechselwirkungen (Gey 2015). Je unpolarer eine Substanz ist, desto intensiver die Wechselwirkungen mit der stationären Phase und desto später eluiert diese. Typischerweise kommen polare Lösungsmittel (Lösungsmittelgemische wie Methanol/Wasser) zum Einsatz.

Was bewirkt ein Laufmittelgradient?

Durch einen Laufmittelgradienten, mit Erhöhung des Anteils des organischen Lösungsmittels und anschließendem Rückspülen des wässrigen Laufmittels, wird garantiert, dass alle Analyten von der Säule eluieren und die Säule für den nächsten Messzyklus reequilibriert ist.

Was passiert nach der chromatographischen Auftrennung der Probe?

Der Einsatz einer HPLC ermöglicht die zeitlich getrennte Ionisierung (Elutionsreihenfolge) und Detektion der Analyten und bietet somit oftmals eine verbesserte Sensitivität.

Ionisierungsmethoden

Es gibt es verschiedene Möglichkeiten die Probe zu ionisieren, dabei wird zwischen harter und weicher Ionisierung unterschieden. Die Ionisierung kann sowohl positiv [M+H]+ als auch negativ [M-H]- erfolgen. Um einige Beispiele zu nennen:

Was ist ein Massenspektrometer und wofür wird es genutzt?

Ein Massenspektrometer ist ein Gerät welches ermöglicht, die Masse und Häufigkeit geladener Teilchen zu ermitteln. Das Prinzip beruht darauf, Moleküle in geladene Ionen zu wandeln, diese nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) zu trennen und anschließend zu detektieren. Die Massenspektrometrie wird beispielsweise verwendet um Strukturen aufzuklären, exakte Massen zu bestimmen, oder die Ionisierbarkeit zu prüfen (Acker und Bremer et al. o.D.).

Aufbau und Funktion eines Massenspektrometers

Zu den Hauptbestandteilen eines Massenspektrometers gehören das Probeeinlasssystem, die Ionenquelle, das Trennsystem bzw. der Analysator (hier werden die Analyten nach ihrem m/z aufgetrennt), der Detektor sowie eine computergestützte Steuer- und Auswerteeinheit.

Grundsätzlich ist für die Trennung und Detektion von Ionen ein geschlossenes Hochvakuumsystem notwendig, da Streuung und Stöße mit Wasserstoff-und Stickstoff -Molekülen Signalüberlagerungen auslösen können. Der Detektor würde durch diese Überlastung stark an Empfindlichkeit verlieren. (Cammann 2010). Das Vakuumsystem setzt sich aus einem Vorvakuum (Druck ca. 10-1 mbar) und einem Hochvakuum (10-4 mbar) zusammen.

Die in der Ionenquelle erzeugten geladenen Analyten werden in Richtung des Detektors beschleunigt. Es gibt vielfältige Möglichkeiten der Ionisierung, wie oben beschrieben, als auch zur Ionentrennung (Gey 2015). In der Ionentrennung werden die Ionen nach ihrem m/z mittels statischer oder dynamischer Methoden getrennt. Magnetische Sektorfeldgeräte trennen Ionen durch ihre Ablenkung in einem starken Magnetfeld (statische Methode). Hingegen wird bei der dynamischer Methode die Ionentrennung in Flugzeitmassenspektrometern bewirkt, in dem entweder die Trennung auf der massenabhängigen Geschwindigkeit der Ionen beruht. Alternativ werden in Quadrupol-Massenspektrometern, in denen die Ionen die vier-zylindrischen-Pole eines elektrischen Wechselfeldes passieren, nur Ionen die im Takt des Wechselfeldes ihre Richtung ändern, vom Massenfilter durchgelassen (Acker und Bremer et al. o.D.).

Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)

Die Tandem-Massenspektrometrie dient Dissoziationen und Fragmentierungen zu studieren und damit auch Strukturaufklärung zu betreiben, zum anderen wird es verwendet, um die Selektivität und Sensitivität einer Quantifizierungsmethode zu verbessern (Massenspektrometrie o.D.). Es gibt mehrere Möglichkeiten um eine Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS, oder MS2) zu induzieren, je nachdem mit welchem Gerätetyp (z.B. Triple-Quadrupol oder Hybrid-Quadrupol/Trap Massenspektrometer) gearbeitet wird und wie die Probe ionisiert wird (hart/weich).

Triple-Quadrupol: Der Ziel-Analyt wird mit einer weichen Ionisierungsmethdode z.B. ESI ionisiert. Das Vorläufer-Ion wird nun gezielt im ersten Quadrupol (Q1) nach ihrem m/z mit einem für das Molekül spezifischen vorausgewählten Ionenübergang von den anderen Ionen getrennt, isoliert und in den zweiten Quadrupol (Q2) weitergeleitet. Durch Kollision mit Stickstoff- oder Argon-Atomen wird das Vorläufer-Ion im Q2 gezielt dissoziiert¹ (molekulare Bruchstücke entstehen), wodurch Produkt-Ionen entstehen. Die molekülspezifischen Bruchstücke werden in den dritten Quadrupol (Q3) weitergeleitet, wo entweder die verschiedenen Ionen gescannt werden (Strukturaufklärung, welche Ionen sind entsanden?) oder nur ein bestimmtes Produkt-Ion wird mit dem zuvor definierten m/z isoliert und anschließend detektiert (selektive Quantifizierung). Diese Technik wird auch Multiple Reaction Monitoring (MRM) genannt (You und Willcox et al. 2013).

Durch harte Ionisierung können die Vorläufer-Ionen bereits in der Quelle fragmentieren² und anschließend wie oben beschrieben weiter analysiert werden, hierdurch entsteht ein Pseudo-MS3. Es wird also ein Produkt-Ion aus der Quelle selektiv im Q1 isoliert, im Q2 dissoziiert und im Q3 ein neues Produkt-Ion ausgehend von dem bereits in der Quelle entstandenen Produkt-Ion isoliert und detektiert. Sofern beide Stufen der Produkt-Ionen einen molekülspezifischen Ionenübergang aufweisen, wird die Selektivität durch den weiteren Schritt erhöht. Durch die Beobachtung von ein, zwei oder mehr (MSn Dissoziationen kann der Zielanalyt sehr empfindlich und selektiv quantifiziert werden.

Die Orbitrab als besonderes Massenspektrometer

Die Orbitrap ist von der Firma Thermo Fisher Scientific stellt eine der jüngsten Entwicklungen der Ionenfallen-Massenspektrometern dar. Die wichtigsten Bauteile dieses Massenspektrometers sind der Quadrupol, die gebogene lineare Ionenfalle (C-Trap), eine Kollisionsinduzierte Dissoziationszelle (engl. Higher-Energy Collisional Dissociation, HCD) und der Orbitrap-Massenanalysator. Der Quadrupol in diesem Instrument dient als Massenfilter für einen breiten oder engen Massenbereich. Er dient lediglich der Isolation des benutzerdefinierten Massenbereiches und nicht einem Scan.

Der Quadrupol

Der Quadrupol besteht aus vier zylindrischen parallel angeordneten Stäben, von denen jeweils die gegenüberliegenden Stäbe die gleiche elektrische Ladung tragen (Gruber und Gruner o.D.). Diese Ladungen wechseln hochfrequent und erzeugen ein elektrisches Wechselfeld. Den Quadrupol können Ionen durch Anpassung des Feldes entsprechend ihres m/z auf einer stabilisierten Flugbahn gezielt passieren. Diese Eigenschaft wird für die Selektion einzelner Massen (Massenfilter) genutzt (Salzer et al. o.D.). Außerdem kann ein Quadrupol auch einen definierten Massenbereich abscannen und somit alle Ionen dieses Größenbereichs passieren lassen.

Die C-Trap

Die C-Trap ist eine aufgebogene, lineare Ionenfalle. Ionen, die den Quadrupol passiert haben, werden hier gesammelt und energetisch gebündelt. Die Kapazität der C-Trap hat eine begrenzte Kapazität für Ionen (3 Mio. Ladungen) und wird durch technische Regulierungen vor Überfüllung und Raumladungseffekten geschützt. Sie dient außerdem der Weiterleitung der Ionen zur HCD-Zelle (,um die Ionen zu dissoziieren) und/oder zum Orbitrap-Massenanalysator (zur Detektion) (Kaufmann und Bromirski 2018).

Die HCD-Zelle

Die HCD-Zelle induziert eine Dissoziation der Ionen durch Stöße mit neutralen (inerten) Gasteilchen, hier Stickstoff (Kaufmann und Bromirski 2018). Die Kollisionsenergie (Collision Energy, CE) steuert die Beschleunigung der N2-Moleküle in der HCD-Zelle und somit die Intensität der Kollisionen, also direkt die Stoßenergie (Gross 2013).

Die Orbitrap als Funktionseinheit

Bei der Orbitrap handelt es sich um eine Ionenfalle, welche weder eine Frequenzanregung noch einen Magneten benötigt, um die Ionen innerhalb der Ionenfalle zu halten. Es findet eine axiale Schwingung der Ionen in einem inhomogenen elektrostatischen Feld statt. Dabei haben kleinere Massen durch eine stärkere Anziehung zum elektrostatischen Feld eine engere Flugbahn als größere. Eine Ionen-Trennung kann erzeugt werden. Die elektrische Anziehung zu der Zentralelektrode wird dabei durch die Zentrifugalkraft kompensiert. Der Orbitrap-Massenanalysator hat zwei Funktionen: Zum einen dient er als Analysator, d.h. er kann die verschiedenen Ionen unterscheiden. Zum anderen dient er, wie oben beschrieben, als Detektor, in dem er die zeitvariablen Signale (Transienten) im Spannungsfeld über eine Fourier-Transformation in Zahlenwerte umwandelt. Grundsätzlich werden am Detektor registrierte Ionen mittels Computerberechnungen in optische Signale umgewandelt und schließlich in einem Massenspektrum durch entsprechende Software dargestellt. Die Frequenzdetektion erfolgt nach Fourier-Transformation des transienten Signals (Gross 2013; Kaufmann und Bromirski 2018). Die Orbitrap Analysatoren dieses Modells zählen zu den auflösungsstärksten Massenspektrometern.

Experimente der Orbitrap

Grundsätzlich können verschiedene Experimente mit der Orbitrap durchgeführt oder auch kombiniert werden. Das sogenannte Full-MS ist ein Experiment, bei dem alle Ionen die innerhalb eines definierten Massenbereichs (m/z) den Quadrupol passieren und ohne Dissoziation in der HCD Zelle direkt in der Orbitrap detektiert werden. Hierbei wird der Quadrupol als Breitband-Massenfilter eingesetzt, der den kompletten Massenbereich der zu analysierenden Moleküle abdeckt. Es werden ausschließlich intakte Vorläufer-Ionen (ggf. Fragmente durch die Ionisierung aber keine Produkt-Ionen analysiert) mit Hochauflösung gemessen.

Beim targeted-Single Ion Monitoring (t-SIM) wird ein sehr enger (z.B. 0.4 Da), benutzerdefinierter Massenbereich im Quadrupol isoliert. Der Orbitrap-Massenanalysator detektiert also nur Ionen dieses kleinen Massenbereichs. Durch die Einstellung des Quadrupols ist die Konzentration der Zielanalyten deutlich höher und es kann länger gesammelt werden, bis die Kapazität erreicht (zeitliche Begrenzung neben der Füllmenge) ist. Die höhere Anzahl an Ziel-Ionen, die an die Orbitrap injiziert werden, führt zu einer höheren Empfindlichkeit.

Das Parallel Reaction Monitoring (PRM) ist ein spezielles tandem-massenspektrometrisches Experiment, bei dem selektive Produkt-Ionenübergänge (für mehrere Analyten parallel) gemessen werden. Der Quadrupol dient hierbei als ein Massenfilter zur Isolation eines Vorläufer-Ions. Nur die Ionen, die in einem engen Massenbereich (z.B. 1 Da) gehören, gelangen in die C-Trap. Die C-Trap transportiert die isolierten Vorläufer-Ionen in die HCD-Zelle, in der die Moleküle durch Kollision mit Stickstoff dissoziieren. Diese entstehenden Produkt-Ionen gelangen zurück in die C-Trap, um dann energetisch-gebündelt in den Orbitrap-Massenanalysator injiziert zu werden. Das PRM ist experimentell vergleichbar mit dem Produkt-Ionenscan eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers MRM (siehe oben), liefert jedoch eine viel höhere Auflösung der Massenspektren.

Der Unterschied zum t-SIM liegt vor allen in der kollisionsinduzierten Dissoziation der Ionen. Der t-SIM ist durch eine geringere Anzahl an Experimenten im Gerät minimal empfindlicher, jedoch überwiegt die Mehrzahl an gewonnener Informationen durch die Produkt-Ionen-Spektren, weshalb dieses Experiment als das „beste“ gilt (Kaufmann und Bromirski 2018). Die zwei intensivsten Peaks der Produkt-Ionen-Spektren werden als Quantifier- und Qualifier-Ionenübergänge ausgewertet. Die benötigte Kollisionsenergie wird während der Methodenentwicklung individuell für die Vorläufer-Ionen angepasst, sodass die Vorläufer-Ionen schließlich kaum mehr im Produkt-Ionen-Spektrum zusehen und die Produkt-Ionen selbst möglichst groß sind (Gross 2013).

¹Molekulare Bruchstücke entstehen durch gezielte Zuführung von Kollisionsenergie und Beschuss mit Gas-Teilchen

²Molekulare Bruchstücke entstehen durch hohe Energie bzw. Ionisierung in der Quelle

Literatur

Acker, Bremer, Dannecker, Däßler, Dreier: Massenspektrometrie. Hg. v. Spektrum Akademischer Verlag. Online verfügbar unter https://www.spektrum.de/lexikon/chemie/massenspektrometrie/5622, zuletzt geprüft am 07.07.2021.

Cammann (2010). Instrumentelle Analytische Chemie: Verfahren, Anwendungen, Qualitätssicherung. 9-1. SpektrumAkademischer Verlag.

Gey (2015): Instrumentelle Analytik und Bioanalytik. Biosubstanzen, Trennmethoden, Strukturanalytik, Applikationen. 3. Aufl. Deutschland: Spinger

Gross, Jürgen H. (2013): Massenspektrometrie. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg.

Gruber; Gruner: Massenspektrometrie. Hg. v. Fraunhofer-Institut für Verfahrenstechnik und Verpackung IVV. Online verfügbar unter https://www.ivv.fraunhofer.de/de/recycling-umwelt/umweltanalytik/massenspektrometrie.html, zuletzt geprüft am 14.01.2021.

Köhrle; Richards, Keith (2020): Mass Spectrometry-Based Determination of Thyroid Hormones and Their Metabolites in Endocrine Diagnostics and Biomedical Research -Implications for Human Serum Diagnostics. In: Experimental and clinical endocrinology & diabetes : official journal, German Society of Endocrinology [and] German Diabetes Association 128 (6-07), S. 358–374. DOI: 10.1055/a-1175-4610.

Massenspektrometrie (o.D.). Hg. v.Chemie.de. Online verfügbar unter https://www.chemie.de/lexikon/Massenspektrometrie.html#MS.2FMS_.28auch_Tandem-Massenspektrometrie.29, zuletzt geprüft am 12.07.2021

Salzer; Thiele; Machill; Zuern; Bezugla; Baetz: Massenspektrometer -Der Massenanalysator -Quadrupol. Hg. v. ChemGaroo-ChemgaPedia. Online verfügbar unter http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/3/anc/masse/ms_massenanalysator_quadrup.vlu.html, zuletzt geprüft am 14.01.2021

Schwedt (2008). Analytische Chemie : Grundlagen, Methoden und Praxis. Weinheim: Wiley-VCH

You; Willcox; Madigan; Wasinger; Schiller; Walsh;. Graham; Kearsley; Li (2013): Tear Fluid Protein Biomarkers.In: Advances in Clinical Chemistry, Elsevier. Volume 62 (4), S. 151-196. Online verfügbar unter https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128000960000044