ELISA-Kit - Info

Was ist die Bedeutung von ELISA?

ELISA steht für Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.Das ELISA-Verfahren gehört zu der Gruppe der Immunassays. Hierbei kann das Vorhandensein eines bestimmten Antigens durch eine antikörpergekoppelte enzymatischen Farbreaktion aufgezeigt werden. Mit niedrigem Material- und Geräteaufwand ist die Analyse von Proben mittels ELISAeine kostengünstige Alternative im Vergleich zu aufwändigeren chromatographischen Methoden wie GC-MS und HPLC.

Was wird mit einem ELISA-Kit nachgewiesen?

Ein solches ELISA-Kit enthält alle Materialien und Reagenzien, um Proteine, Antikörper und Viren oder auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Pestizide und Toxine in einer Probe nachzuweisen.

Beschichtete versus unbeschichtete ELISA Kits

Bei der Auswahl eines geeigneten ELISA Kits wird zwischen beschichteten und unbeschichteten ELISA Kits unterschieden.

Ein beschichtetes ELISA-Kit, sind bereits mit einem Fängerantiköper (engl. capture antibody), oder im Falle eines ELISA zum Nachweis eines Antikörpers, mit einem Fänger-Antigen (engl. capture antigen) versehen.

Der Vorteil liegt hierbei in der Vergleichbarkeit zischen den ELISA und der schnellen Durchführung.

Ein unbeschichtetes ELISA-Kit muss zunächst mit den mitgelieferten Reagenzien beschichtet werden.

Zwar kostet dieser Prozess mehr Zeit, hier ist allerdings ein günstigerer Preis zu erwarten und zusätzlich die Modifikation des ELISA Tests möglich.

Wie funktioniert ein ELISA Kit (Sandwich)?

Das ELISA Kit enthält eine Mikrotiterplatte mit 96 einzelnen Reaktionsräumen. Der Boden der Mikrotiterplatte wurde mit Antikörpern beschichtet, die gegen das gesuchte Antigen gerichtet sind (siehe 1).

Im ersten Schritt wird die Probe in die Reaktionsräume des ELISA Kits gegeben. Ist das gesuchte Antigen in der Probe enthalten, wird es von den auf der Mikrotiterplatte fixierten Antikörpern gebunden (siehe 2). Anschließend ist es wichtig, die Platte zu waschen, um ungebundene Bestandteile, welche die Messung verfälschen würden, zu entfernen.

Im zweiten Schritt wird ein weiterer polyklonaler Antikörper, der mit einem Reporterenzym (z.B. Biotin) verbunden ist, zu dem Antikörper-Antigen-Komplex gegeben. Dieser "Detektionsantikörper" (als "Detection Reagent A" im ELISA Kit enthaltene Antikörper) bindet an andere Epitope (Bindestellen) des Antigens als der erste fixierte. Auf diese Weise entsteht ein sogenannter "Sandwich-Komplex" aus Erstantikörper, Antigen und Zweitantikörper (siehe 3).

Ein erneutes Waschen sorgt für die Entfernung nicht gebundener Enzymkonjugate und damit für ein unverfälschtes Messergebnis.

Im Anschluss wird die Eigenschaft von Avidin (Hühnereiweiß), Biotin zu binden, genutzt, um das für die Farbreaktion benötigte Enzym (HRP = horse radish peroxidase) an den "Sandwich-Komplex" zu binden. Dazu wird mit HRP konjugiertes Avidin (als Detection Reagent B im ELISA Kit enthalten) in die einzelnen Reaktionsräume der Mikrotiterplatte gegeben (siehe 4).

Der Zwischenschritt über die Avidin-Biotin-Bindung dient der Signalverstärkung und ist vor allem dann von Nutzen, wenn die nachzuweisende Verbindung in sehr geringen Mengen vorliegt. Bevor die Farbreaktion eingeleitet werden kann ist es wichtig, nicht gebundene Enzymkonjugate durch erneutes Waschen aus den Reaktionsräumen zu entfernen.

Die enzymatische Farbreaktion wird durch die Zugabe eines zunächst farblosen Substrates (TMB = 3, 3’, 5, 5’- Tetramethylbenzidin) induziert, welches in Gegenwart von Peroxidasen eine dunkelblaue Färbung zeigt. Nach einer bestimmten Reaktionszeit wird das Enzym (HRP) durch Zugabe einer Säure (z. B. Schwefelsäure) denaturiert und die Reaktion somit gestoppt. Dabei schlägt aufgrund der Veränderung des pH-Wertes die Farbe des TMBs von blau nach gelb um.

Die Farbintensität (Extinktion) kann mithilfe eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes photometrisch bei einem Absorbtionsmaximum von 450 nm bestimmt werden. Ein Vergleich der gemessenen Extinktion mit einer zuvor erstellten Standardgeraden ermöglicht, die genaue Quantifizierung der nachzuweisenden Verbindung in der Probe.

Wie unterscheidet sich ein Sandwich-ELISA Kit von einem kompetitiven ELISA?

Der Sandwich-Ansatz konzentriert sich rein auf das Vorhandensein eines nachzuweisenden Analyten. Ist dieser vorhanden, kann der Detektionsantikörper binden und das Verfahren führt zu einem messbaren Signal. Die Signalstärke ist dabei proportional zur Analytenmenge: Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist, desto mehr Detektionsantikörper können binden und desto stärker ist das Signal.

Ein kompetitiver ELISA setzt hingegen auf den Wettkampf (engl. competition) zwischen dem nachzuweisenden Analyten und einem Kompetitor-Antigen. Dieses Kompetitor-Antigen ersetzt dabei den Detektionsantikörper und ist daher mit einem Signal-gebenden Substanz markiert.

Während sich der nachzuweisende Analyt nicht im Versuchsaufbau befindet, bindet das Kompetitor-Antigen an den fixierten Antiköper. Die Bindung zwischen den beiden ist allerdings etwas schwächer, im Vergleich zu der Bindung zwischen dem fixierten Antikörper und dem nachzuweisenden Analyt.

Wird nun eine Probe mit dem nachzuweisenden Analyten hinzugegeben, kämpfen beide Analyten um die Bindung an den fixierten Antikörper.

Der Versuchsansatz ist dabei so ausgelegt, dass der nachzuweisende Analyt das Kompetitor-Antigen von der Bindefläche verdrängt. Da das Kompetitor-Antigen den Frabstoff trägt ist die gemessene Signalintensität umgekehrt proportional zur nachzuweisenden Analyten Menge: Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger Kompetitor-Antigene können binden und desto schwächer ist das Signal.

Warum werden bei einem Sandwich ELISA-Test oft monoklonale Antikörper eingesetzt?

Der Einsatz von fixierten monoklonalen Antikörpern ermöglicht die genaue Bindung des nachzuweisenden Antigens. Hierbei soll das Antigen gleichmäßig gebunden werden und möglichst keine Kreuzreaktion zu anderen Proteinen innerhalb der Probe entstehen.

Um nun den gebundenen Analyten nachzuweisen, können hingegen polyklonale Antikörper verwendet werden, da zum einen durch die vorherigen Waschschritte, andere Proteine weggewaschen wurden, zum anderen hilft die Bindung mehrere Antikörper an einen Analyten den ELISA-Test auch bei geringen Probenmengen ausreichen sensitiv zu machen.

Biotin und Streptavidin in Sandwich-ELISA-Kits

Biotin und Streptavidin werden aufgrund ihrer starken und spezifischen Bindungseigenschaften, die einen empfindlichen Nachweis von Zielanalyten ermöglichen, häufig in einem Sandwich-Enzymimmunoassay (ELISA) verwendet.

Bei einem Sandwich-ELISA besteht das Grundprinzip darin, den interessierenden Analyten, in der Regel ein Protein oder Antigen, mit einem Antikörperpaar einzufangen. Ein Antikörper, der so genannte Capture-Antikörper, ist auf einer festen Oberfläche, z. B. einer Mikroplattenvertiefung, immobilisiert und dient dazu, den Analyten aus der Probe einzufangen. Der andere Antikörper, der so genannte Nachweisantikörper, ist mit einem Enzym konjugiert und dient zum Nachweis des eingefangenen Analyten.

Biotin ist ein kleines Vitamin, das sich durch chemische Reaktionen leicht an Proteine, einschließlich Antikörper, konjugieren lässt. Streptavidin hingegen ist ein aus Streptomyces-Bakterien stammendes Protein, das eine extrem hohe Affinität für Biotin aufweist, was es zu einer der stärksten bekannten nicht-kovalenten Wechselwirkungen in der Natur macht.

Bei einem Sandwich-ELISA wird der Fänger-Antikörper auf der festen Oberfläche der Vertiefung der Mikroplatte immobilisiert, und der Analyt aus der Probe wird durch spezifische Bindung an den Fänger-Antikörper gefangen. Dann wird der mit Biotin konjugierte Nachweisantikörper in die Vertiefung gegeben. Der biotinylierte Nachweisantikörper bindet spezifisch an ein anderes Epitop auf dem eingefangenen Analyten und bildet einen "Sandwich"-Komplex mit dem Fängerantikörper.

Anschließend wird Streptavidin, das mit einem Enzym wie Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert ist, in die Vertiefung gegeben. Streptavidin bindet mit hoher Affinität an den biotinylierten Detektionsantikörper und bildet so eine Brücke zwischen dem Fänger-Antikörper-Analyt-Komplex und dem enzymmarkierten Detektionsantikörper.

After washing to remove unbound components, a substrate solution containing a substrate specific to the enzyme is added to the well. The enzyme on the streptavidin then reacts with the substrate, generating a detectable signal, such as a color change or luminescence, which is proportional to the amount of analyte present in the sample. This signal can be measured using a microplate reader, allowing for quantification of the analyte concentration.

Nach dem Waschen, um ungebundene Komponenten zu entfernen, wird eine Substratlösung, die ein für das Enzym spezifisches Substrat enthält, in die Vertiefung gegeben. Das Enzym auf dem Streptavidin reagiert dann mit dem Substrat und erzeugt ein nachweisbares Signal, wie z. B. eine Farbänderung oder Lumineszenz, die proportional zur Menge des in der Probe vorhandenen Analyten ist. Dieses Signal kann mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen werden, was eine Quantifizierung der Analytkonzentration ermöglicht.

Die Verwendung von Biotin und Streptavidin in einem Sandwich-ELISA bietet mehrere Vorteile, darunter hohe Empfindlichkeit und Spezifität aufgrund der starken und spezifischen Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung. Sie ermöglicht auch eine flexible Gestaltung des Assays, da verschiedene biotinylierte Detektionsantikörper in Kombination mit demselben Streptavidin-konjugierten Enzym verwendet werden können, was Multiplexing und die Anpassung des Assays an verschiedene Analyten ermöglicht.

ELISA-Tests finden Anwendung im Kampf gegen Corona

Angesichts der SARS-CoV-2 Pandemie fand das ELISA-Test Prinzip auch Anklang in der Diagnostik von Antikörper, die im Zuge eine überstandenen SARS-CoV-2 Infektion im Körper der Genesenen nachweisbar sind. Hierbei kann sich zum Beispiel dier Isotyp und die spezifische Bindung an das Spike-Protein des Virus als besonders nützlich darstellen.

Aus diesem Gedankengang entwickelten sich außerdem sogenannte Neutralization Assays.

Neutralization Assays helfen dabei zirkulierende, neutralisierende Antikörper gegen SARS-CoV-2 nachzuweisen. Besonders angesichts überstandener COVID-19 Erkrankungen, sowie dem fortschreitenden Impfprozess können so wichtige Erkenntnisse über Antikörper gegen SARS-CoV-2 erlangt werden.

Die eigentliche „Neutralisation“ basiert auf der Blockierung der Interaktion zwischen der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des viralen Spike-Glykoproteins mit dem ACE2-Zelloberflächenrezeptor.

Hier wirken die neutralisierenden Antikörper also genauso wie das Kompetitor-Antigen im Falle eines kompetitiven ELISA.

Worauf sollte bei einem Kauf von einem ELISA-Test geachtet werden?

Als Wissenschaftler kennen Sie sich am besten mit dem eigenen Versuchsaufbau und der zu lösenden Fragestellung aus.

Bei der Auswahl eines geeigneten ELISA sollten Sie sich dennoch über die folgenden Punkte genaue Gedanken machen:

In den jeweiligen Klammern finden Sie den jeweiligen Filter-Abschnitt, durch den Sie innerhalb Ihrer Suche am linken Bildschirmrand, genau das gesuchte Produkt definieren können.

Welche ELISA-Kits kann man bei Hölzel kaufen?

Seit 1993 verkaufen wir ELISA-Kits für die Forschung und Diagnostik.

Über die Jahren konnten wir ein beachtliches Portfolio mit mehr als 100 ELISA-Herstellern und über 1 Millionen ELISA-Kits aufbauen.

Im folgenden haben wir ein paar interessante ELISA-Kits rausgesucht.

Sollte diese Auswahl noch nicht weiter geholfen haben, so könen Sie uns gerne eine Produktanfrage senden.