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Question 1: Does biotinylated actin have the same polymerization dynamics as unlabeled actin?
Answer 1: The biological activity of biotinylated actin ((Cat. #AB07) can be determined from its ability to efficiently polymerize into filaments in vitro and separate from unpolymerized components in a spin down assay. Stringent quality control ensures that 80-90% of the biotinylated actin can polymerize in this assay. This is comparable to the polymerization capacity of unmodified actin (Cat. #AKL99).
Question 2: Can the biotinylated actin be used in a pull-down format to capture novel actin binding proteins?
Answer 2: Yes, the biotinylated actin ((Cat. #AB07) can be used to pull-down actin binding proteins with streptavidin beads. Below is a protocol:
1. Polymerize biotin actin at 0.4 mg/ml, using 20 mg AB07 plus 180 mg of unlabeled actin (Cat. #AKL99) for 1 h at RT, (alternatively for a monomer binding test, use AB07 diluted to 0.4 mg/ml in A-buffer for 1 h at RT, and add that to the beads 1 mg per 1 ml of beads)
2. Stabilize with 1 mM phalloidin (Sigma) added from 200 mM stock in methanol, diluted to 20 mM in F-actin buffer.
3. Mix with 200 ml packed volume of streptavidin beads washed with F-actin + phalloidin buffer. Incubate for 1 h at RT on a rotator 20 rpm, then wash again with 2 x 1 ml of F-actin + phalloidin buffer.
4. Use 20 mg AB07 per reaction = 20 ml of beads, plus 1 mg of cell extract protein. The assay uses the same binding conditions as in BK001, i.e., no more than 75 mM total ionic strength.
5.After 20 min incubation at RT, spin at 1000 rpm for 20 sec, pipette off supernatant, and save for a gel.
6. Wash the beads 2 x 1ml in binding buffer, then resuspend in 40 ml of 2x SDS loading buffer, heat to 95°C for 2 min and load 20 ml onto into the well, and load the supernatant sample next to it.
7. Three good controls are extract alone, streptavidin beads alone, and the monomer beads versus F-actin beads, all should be run with both pellet and supernatant samples.
Hinweis: Die dargestellten Informationen und Dokumente (Bedienungsanleitung, Produktdatenblatt, Sicherheitsdatenblatt und Analysezertifikat) entsprechen unserem letzten Update und sollten lediglich der Orientierung dienen. Wir übernehmen keine Garantie für die Aktualität. Für spezifische Anforderungen bitten wir Sie, uns eine Anfrage zu stellen.
Alle Produkte sind nur für Forschungszwecke bestimmt. Nicht für den menschlichen, tierärztlichen oder therapeutischen Gebrauch.
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